文獻內容講解

巨(ju)自噬（以下簡稱自噬）涉及膜(mo)的初始(shi)形成(cheng)，將細胞質(zhi)中(zhong)需(xu)要分(fen)(fen)解的物質(zhi)隔離形成(cheng)雙(shuang)膜(mo)自噬體(ti)，自噬體(ti)隨(sui)后與溶酶體(ti)接觸，進而(er)融(rong)合，從而(er)使物質(zhi)分(fen)(fen)解和由此產生的大分(fen)(fen)子(zi)循環，以在(zai)饑餓(e)和細胞應激期間獲(huo)得穩態。

自噬體(ti)(ti)的(de)生(sheng)物發生(sheng)通過(guo)ULK1激(ji)酶(mei)復(fu)(fu)合(he)物和III類(lei)磷(lin)脂酰肌(ji)醇3激(ji)酶(mei)復(fu)(fu)合(he)物1(PIK3C3-C1)聚集到內質(zhi)網(ER)相關位(wei)點啟動，新形成(cheng)(cheng)的(de)自噬體(ti)(ti)即從這些(xie)位(wei)點發出。自噬體(ti)(ti)膜(mo)很大程度上缺乏跨膜(mo)蛋白，因此認為其形成(cheng)(cheng)受膜(mo)相關蛋白及其脂質(zhi)組成(cheng)(cheng)和分布的(de)調節(jie)。

前人研究表(biao)明(ming)，自(zi)(zi)(zi)噬體富含不飽和脂(zhi)肪(fang)酸，而這些(xie)脂(zhi)肪(fang)酸是自(zi)(zi)(zi)噬體形(xing)成所必(bi)需的。這些(xie)研究表(biao)明(ming)，降低(di)膜(mo)序有利(li)于自(zi)(zi)(zi)噬的啟動，可能是通過(guo)產(chan)生已(yi)知(zhi)的自(zi)(zi)(zi)噬體形(xing)成所需的柔性高度彎曲的膜(mo)。除了磷脂(zhi)、膽固(gu)醇是哺乳動物膜(mo)的一個重(zhong)要(yao)組成部分(fen)，它的豐度也是膜(mo)秩(zhi)序和流動性的決定因素。

細胞(bao)內膽(dan)固醇水(shui)平通過生物發生和(he)細胞(bao)外膽(dan)固醇攝取進行(xing)雙重調節。除了低(di)密(mi)度脂蛋白受體(LDLR)途徑(jing)外，一些膽(dan)固醇轉運蛋白也被(bei)證(zheng)明直接(jie)從(cong)質(zhi)膜(mo)(PM)介導(dao)膽(dan)固醇的(de)輸(shu)入(ru)和(he)胞(bao)內轉運。這(zhe)(zhe)種膽(dan)固醇轉運蛋白例(li)如(ru) GramD 家族蛋白（由GramD1A、GramD1B、GramD1C（也稱(cheng)為ASTER蛋白）、GramD2和(he)GramD3)，以其N-末端區域(yu)(yu)的(de)脂質(zhi)結(jie)(jie)(jie)合PH相似(si)結(jie)(jie)(jie)構域(yu)(yu)命名。在這(zhe)(zhe)5個成(cheng)員中，只有GramD1A、GramD1B和(he)GramD1C（這(zhe)(zhe)里(li)統稱(cheng)為GramD1S)含有一個與甾(zai)醇結(jie)(jie)(jie)合的(de)巨大結(jie)(jie)(jie)構域(yu)(yu)，允許它(ta)們促進PM到ER膽(dan)固醇的(de)輸(shu)入(ru)。

GramD1S的(de)缺(que)失導(dao)致細胞膜中可及膽固醇的(de)積累,而GramD1A和GramD1B缺(que)失的(de)小(xiao)鼠巨噬細胞也表現出甾醇調節(jie)元件結合(he)蛋白2(SREBP2)靶基因的(de)上(shang)調表達，表明ER膽固醇降低。由于對GramD家(jia)族(zu)蛋白質的(de)研究數量有限，它們的(de)生物學重要性(xing)仍(reng)未深入了解。

膽固醇耗竭促進(jin)自噬啟(qi)動(dong)

此項研究用快速清除細(xi)(xi)胞膜中(zhong)膽(dan)(dan)固(gu)醇的(de)(de)MBCD分析了(le)(le)膽(dan)(dan)固(gu)醇耗(hao)(hao)盡后饑(ji)餓(e)誘導的(de)(de)自(zi)噬(shi)的(de)(de)短期影響。對照細(xi)(xi)胞相(xiang)比，在基礎條件(jian)下，膽(dan)(dan)固(gu)醇耗(hao)(hao)竭(jie)導致LC3B(LC3B-II)的(de)(de)膜結合形式增(zeng)加了(le)(le)三(san)倍，這在缺乏膽(dan)(dan)固(gu)醇的(de)(de)饑(ji)餓(e)細(xi)(xi)胞中(zhong)進一步增(zeng)強；據(ju)內源(yuan)性LC3B點狀體的(de)(de)免疫熒(ying)光(guang)顯微鏡觀察，膽(dan)(dan)固(gu)醇耗(hao)(hao)竭(jie)增(zeng)加了(le)(le)Fed和Starved細(xi)(xi)胞中(zhong)自(zi)噬(shi)體的(de)(de)形成。這些(xie)結果表明(ming)，膽(dan)(dan)固(gu)醇耗(hao)(hao)竭(jie)促進自(zi)噬(shi)誘導，并(bing)增(zeng)強饑(ji)餓(e)誘導的(de)(de)自(zi)噬(shi)。

為了闡明(ming)細(xi)胞膽(dan)固(gu)醇調節劑是否也影響(xiang)自(zi)(zi)噬(shi)(shi)，設計(ji)實驗(yan)耗(hao)竭在膜接觸點作(zuo)為非泡(pao)狀細(xi)胞器間(jian)膽(dan)固(gu)醇運動中(zhong)介的膽(dan)固(gu)醇轉(zhuan)運蛋(dan)白(bai)。鑒于(yu)復合物通過其(qi)C端區(qu)域22和GramD1A參與自(zi)(zi)噬(shi)(shi)，為明(ming)確GramD1A家族(zu)的其(qi)他成員(yuan)是否也參與自(zi)(zi)噬(shi)(shi)，用siRNA轉(zhuan)染穩(wen)定誘(you)導表達(da)自(zi)(zi)噬(shi)(shi)報告基因Mcherry-EGFP-LC3B（黃色自(zi)(zi)噬(shi)(shi)體，由于(yu)酸性溶(rong)(rong)酶體中(zhong)EGFP猝滅而產生的紅自(zi)(zi)溶(rong)(rong)酶體）的U2OS細(xi)胞，分別耗(hao)盡每個(ge)Gram家族(zu)成員(yuan)。這些實驗(yan)數據表明(ming)，GramD1C介導的膽(dan)固(gu)醇轉(zhuan)運調節饑(ji)餓誘(you)導的自(zi)(zi)噬(shi)(shi)。

U2OS細(xi)胞中(zhong)(zhong)GramD1C耗竭導(dao)致(zhi)了幾種早(zao)期自噬機(ji)制成分(fen)的增加(jia)，如ATG13、ATG16L1和PTDINs(3)P效應(ying)蛋白(bai)WIPI2B40；而且與膽固醇(chun)耗竭細(xi)胞中(zhong)(zhong)的結果一致(zhi)，研究發現GramD1C耗竭促進饑餓細(xi)胞中(zhong)(zhong)EGFP-BAT的募(mu)集，這些(xie)結果提示GramD1C通過降低膜(mo)曲率抑(yi)制自噬體的啟(qi)動。

為了(le)研究GramD1C是(shi)否可能調節(jie)(jie)內質(zhi)網和(he)線(xian)粒(li)體(ti)(ti)之間的(de)膽固(gu)醇(chun)(chun)運動(dong)，我們在分離的(de)線(xian)粒(li)體(ti)(ti)中加入重組Mcherry標(biao)記的(de)perfringolysin O(Mcherry-D4)膽固(gu)醇(chun)(chun)結(jie)合域，建立(li)了(le)一種線(xian)粒(li)體(ti)(ti)膽固(gu)醇(chun)(chun)定量方法。后續通(tong)過一系列實驗證明(ming)GramD1C是(shi)線(xian)粒(li)體(ti)(ti)膽固(gu)醇(chun)(chun)豐度和(he)線(xian)粒(li)體(ti)(ti)生物(wu)能量學的(de)負(fu)調節(jie)(jie)因子。

Gram家族(zu)表達對CCRCC預后的影響

通過TCGA數據(ju)庫分析腎(shen)透明細胞(bao)癌(ai)(KIRC)腫瘤基因表達數據(ju)中(zhong)完整的Gram1C家(jia)族在CCRCC中(zhong)的參(can)與情況，及患者生存(cun)的相關性(xing)，發現GRAMD1C、GRAMD2B是腎(shen)透明細胞(bao)癌(ai)(CCRCC)患者預后的不利因素；Gram家(jia)族成(cheng)員可能(neng)是通過調節新陳代謝和癌(ai)細胞(bao)存(cun)活(huo)率來調節CCRCC患者的總存(cun)活(huo)率。