1. SD大鼠(shu)，250g，通過頸(jing)椎脫(tuo)位(wei)處死大鼠，浸(jin)入(ru)75%乙醇浸泡(pao)5分鐘，轉移到通風柜中的解剖盤中。

2. 打開(kai)皮(pi)膚，暴(bao)露(lu)、收(shou)集股(gu)骨，無菌狀(zhuang)態下移除附(fu)著的肌肉和組織。

3. 并轉移(yi)股骨至(zhi)預冷含雙抗的PBS中(zhong)，洗滌三次。冰上操作。

4. 切斷股骨骨骺， 使用5mlPBS，1ml注射器針頭沖(chong)洗，沖(chong)洗液由棕色(se)變(bian)成(cheng)粉紅色(se)即可（股骨變(bian)白(bai)）。沖(chong)洗后(hou)，用1ml注射器吹(chui)打(da)3-5次。

5. 70um濾網過濾，棄去篩(shai)網。使用 15ml 離心管，先加(jia)(jia)入分離液(ye)，然后緩慢加(jia)(jia)入濾過的懸液(ye)。20℃環境下，600g 離(li)心(xin) 25min。

6. 離心(xin)后，離心(xin)管(guan)中液(ye)(ye)體由(you)上(shang)至下(xia)分為(wei)(wei)(wei)四層(ceng)(ceng)(ceng)。第(di)一(yi)層(ceng)(ceng)(ceng)為(wei)(wei)(wei)稀(xi)釋液(ye)(ye)層(ceng)(ceng)(ceng)。第(di)二層(ceng)(ceng)(ceng)為(wei)(wei)(wei)環狀乳白色單個核細(xi)胞層(ceng)(ceng)(ceng)。第(di)三層(ceng)(ceng)(ceng)為(wei)(wei)(wei)透明分離液(ye)(ye)層(ceng)(ceng)(ceng)。第(di)四層(ceng)(ceng)(ceng)為(wei)(wei)(wei)紅細(xi)胞層(ceng)(ceng)(ceng)。

7. 小心吸取離心管中(zhong)的，環狀乳白色(se)單個核細胞層(ceng)，轉移到新離心管中(zhong)，加入 5-10ml 洗(xi)滌液，混(hun)勻(yun)細胞。400g，離心 10min。

8. 棄去上(shang)清，用(yong)吸(xi)管(guan)吸(xi)取 5ml 清洗液重懸(xuan)所得細胞。 250g，離心 10min，棄去上清。 再用M199培養基（含10 ng/mL VEGF，1 ng/mL b-FGF，1 ng/mL EGF，20%胎牛(niu)血清、1%雙抗）清洗一(yi)次，棄去上(shang)清，M199培養基重懸細胞(bao)。250g，離心 10min，棄去(qu)上(shang)清。M199培養基重(zhong)懸(xuan)細胞，計數。

9. 按(an)3×10⁶/孔種入纖(xian)連蛋白包被過的24孔板，每3天換一次培養(yang)基，以去除非貼壁細胞，持續誘導培養(yang)2-3周。