脊髓神經元原代培養細胞實驗

　　一、背景

　　神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)原代培(pei)養(yang)(yang)是(shi)將胚(pei)胎哺乳動(dong)物(wu)中樞神(shen)(shen)經(jing)系統(tong)的部分組織，如大腦(nao)皮層(ceng)、海馬(ma)、脊髓等(deng)腦(nao)組織直接取出，再(zai)接種(zhong)培(pei)養(yang)(yang)的方(fang)法。目前國內、外(wai)有關神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)培(pei)養(yang)(yang)的方(fang)法較(jiao)多，但在(zai)原代培(pei)養(yang)(yang)中神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)的純度和產量方(fang)面還(huan)存在(zai)一些急待解決(jue)的問題(ti)。由(you)于(yu)神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)是(shi)一種(zhong)高度分化(hua)的細胞，相(xiang)對于(yu)其它細胞而(er)言，神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)在(zai)體(ti)外(wai)更難以(yi)存活和生(sheng)長。因(yin)此，體(ti)外(wai)培(pei)養(yang)(yang)神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)要(yao)求的培(pei)養(yang)(yang)方(fang)法和營養(yang)(yang)條件均較(jiao)為特殊(shu)。

　　神(shen)(shen)經細胞(bao)的(de)(de)(de)體外(wai)(wai)(wai)培(pei)養(yang)技術是研(yan)究神(shen)(shen)經源性(xing)(xing)疾病(bing)(bing)的(de)(de)(de)發(fa)病(bing)(bing)機制、進程(cheng)的(de)(de)(de)一個重(zhong)要工具(ju)，能很好(hao)的(de)(de)(de)、直(zhi)觀的(de)(de)(de)反(fan)映離體神(shen)(shen)經元的(de)(de)(de)發(fa)育狀況和生理活(huo)性(xing)(xing)，如何(he)建(jian)立一個穩定成熟的(de)(de)(de)神(shen)(shen)經細胞(bao)培(pei)養(yang)體系是神(shen)(shen)經系統(tong)疾病(bing)(bing)體外(wai)(wai)(wai)實驗研(yan)究順利進行的(de)(de)(de)基礎。隨著(zhu)基礎醫學及(ji)臨(lin)床醫學研(yan)究的(de)(de)(de)逐漸深入，神(shen)(shen)經細胞(bao)的(de)(de)(de)體外(wai)(wai)(wai)培(pei)養(yang)技術在腦(nao)損傷、神(shen)(shen)經障礙性(xing)(xing)疾病(bing)(bing)、衰老相關(guan)神(shen)(shen)經疾病(bing)(bing)方面(mian)得到廣泛重(zhong)視和普及(ji)應(ying)用。

　　二、脊髓神經元原代培養細胞實驗實驗步驟

　　(1)75%(體積(ji)分數(shu))酒精消毒孕鼠(shu),在無菌條件下(xia)取出胎鼠(shu),分離并切取脊髓,置(zhi)于冷的無鈣、鎂的HBSS液的平皿中(zhong)(下(xia)置(zhi)冰(bing)袋)。

　　(2)解剖顯微鏡無菌條件下仔(zi)細剝(bo)離脊膜(mo)及血管。

　　(3)用彈簧剪將脊髓剪成1cm3大小，消(xiao)(xiao)化(hua)液(ye)37℃消(xiao)(xiao)化(hua)15-20min，每(mei)五分(fen)鐘振蕩(dang)一次；

　　(4)去(qu)掉上清(qing)(qing)，加入終止(zhi)液終止(zhi)消(xiao)化，吹打10-15次(ci)，不能有(you)氣泡，收集上清(qing)(qing)，剩(sheng)余組織(zhi)再消(xiao)化一次(ci)。

　　(5)4℃1000rpm離心10min，棄上(shang)清，加入種(zhong)植液(ye)1重懸(xuan)，培養(yang)箱內差速貼壁30min；

　　(6)收集(ji)上清，臺盼藍染色(se)計數，按(an)6*105cells/孔(kong)種入(ru)六孔(kong)板（種植(zhi)液1），37℃，5%CO2，95%飽和(he)濕度(du)的培養箱中培養；

　　(7)培養第二天(tian)，全(quan)換液更換為種植液2；

　　(8)培(pei)養第(di)四天，半(ban)量換(huan)液加入(ru)5uM的阿糖胞苷，24h全量換(huan)液；

　　(9)之后每周換(huan)液兩(liang)次(ci)。