大腦皮層神經元原代培養細胞實驗

　　一、背景

　　神(shen)(shen)經(jing)(jing)元原代培(pei)(pei)(pei)養(yang)是將胚胎哺乳動物(wu)中樞神(shen)(shen)經(jing)(jing)系(xi)統的部分(fen)組(zu)織，如大(da)腦皮層、海馬、脊髓等腦組(zu)織直接取出，再(zai)接種培(pei)(pei)(pei)養(yang)的方(fang)(fang)法。目前國內、外有關神(shen)(shen)經(jing)(jing)元培(pei)(pei)(pei)養(yang)的方(fang)(fang)法較(jiao)多(duo)，但(dan)在原代培(pei)(pei)(pei)養(yang)中神(shen)(shen)經(jing)(jing)元的純度和產量方(fang)(fang)面還存在一些急(ji)待解決的問題。由于神(shen)(shen)經(jing)(jing)元是一種高度分(fen)化的細胞，相(xiang)對于其它細胞而言，神(shen)(shen)經(jing)(jing)元在體(ti)(ti)外更難以(yi)存活(huo)和生長(chang)。因此，體(ti)(ti)外培(pei)(pei)(pei)養(yang)神(shen)(shen)經(jing)(jing)元要求(qiu)的培(pei)(pei)(pei)養(yang)方(fang)(fang)法和營養(yang)條件均較(jiao)為特殊。

　　神(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)細胞的(de)(de)體(ti)(ti)外(wai)培(pei)(pei)養技術(shu)是(shi)(shi)研究神(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)源性(xing)疾(ji)(ji)病(bing)(bing)的(de)(de)發(fa)病(bing)(bing)機制、進程的(de)(de)一個重(zhong)要工具，能(neng)很好的(de)(de)、直觀的(de)(de)反映(ying)離(li)體(ti)(ti)神(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)元的(de)(de)發(fa)育(yu)狀況(kuang)和生理活性(xing)，如(ru)何建立一個穩(wen)定成(cheng)熟的(de)(de)神(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)細胞培(pei)(pei)養體(ti)(ti)系是(shi)(shi)神(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)系統(tong)疾(ji)(ji)病(bing)(bing)體(ti)(ti)外(wai)實驗研究順利進行的(de)(de)基礎(chu)。隨(sui)著(zhu)基礎(chu)醫(yi)學及臨床(chuang)醫(yi)學研究的(de)(de)逐(zhu)漸深(shen)入，神(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)細胞的(de)(de)體(ti)(ti)外(wai)培(pei)(pei)養技術(shu)在(zai)腦損傷、神(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)障(zhang)礙(ai)性(xing)疾(ji)(ji)病(bing)(bing)、衰(shuai)老相關(guan)神(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)疾(ji)(ji)病(bing)(bing)方面(mian)得到廣(guang)泛重(zhong)視和普及應用。

　　二、大腦皮層神經元原代培養細胞實驗步驟

　　(1)75%(體積分(fen)數)酒精消毒孕鼠,在無菌條件(jian)下(xia)取出(chu)胎鼠,分(fen)離并切(qie)取大腦皮層,置于冷的(de)無鈣、鎂的(de)HBSS液的(de)平皿中(下(xia)置冰袋)。

　　(2)解(jie)剖(pou)顯微鏡無(wu)菌條件下(xia)仔細剝離大腦皮層(ceng)。

　　(3)用彈簧剪(jian)將大腦皮層剪(jian)成1cm3大小，消化(hua)液37℃消化(hua)15-20min，每五(wu)分(fen)鐘振(zhen)蕩一次；

　　(4)去掉上清，加入終止液終止消化(hua)，吹打(da)10-15次，不能有氣泡(pao)，收集上清，剩(sheng)余組織再(zai)消化(hua)一(yi)次。

　　(5)4℃1000rpm離心10min，棄(qi)上清，加入種植液1重懸，培養箱內差速貼壁(bi)30min；

　　(6)收集上清，臺盼(pan)藍染色(se)計數(shu)，按6*105cells/孔(kong)種(zhong)入六孔(kong)板(ban)（種(zhong)植液1），37℃，5%CO2，95%飽和(he)濕度的(de)培養箱中培養；

　　(7)培養第(di)二天，全換(huan)液更換(huan)為種植液2；

　　(8)培(pei)養第四天(tian)，半量(liang)換(huan)液加入5uM的阿糖胞苷，24h全量(liang)換(huan)液；

　　(9)之后每周換液兩次(ci)。