一、背景

　　神經元原代培養是將胚(pei)胎(tai)哺乳動物中(zhong)樞神經系統的(de)部分(fen)組(zu)(zu)織，如大腦皮(pi)層、海馬、脊髓等(deng)腦組(zu)(zu)織直接(jie)取出(chu)，再接(jie)種(zhong)培養的(de)方(fang)法。目(mu)前(qian)國內、外(wai)有關神經元(yuan)培養的(de)方(fang)法較多，但在原(yuan)代培養中(zhong)神經元(yuan)的(de)純度(du)和產量方(fang)面還存(cun)在一(yi)些急待解決(jue)的(de)問題。由(you)于神經元(yuan)是一(yi)種(zhong)高度(du)分(fen)化(hua)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)，相對于其(qi)它細(xi)(xi)胞(bao)而言，神經元(yuan)在體外(wai)更(geng)難(nan)以存(cun)活和生長。因此，體外(wai)培養神經元(yuan)要求的(de)培養方(fang)法和營養條件均較為特殊。

　　神(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)細胞(bao)的(de)(de)體(ti)外培養(yang)(yang)技(ji)術(shu)是研(yan)究神(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)源性(xing)疾病(bing)(bing)的(de)(de)發病(bing)(bing)機制、進(jin)程的(de)(de)一(yi)個重要工具，能很(hen)好的(de)(de)、直觀的(de)(de)反映離體(ti)神(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)元的(de)(de)發育狀況和生理活(huo)性(xing)，如何建立一(yi)個穩(wen)定(ding)成(cheng)熟(shu)的(de)(de)神(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)細胞(bao)培養(yang)(yang)體(ti)系(xi)是神(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)系(xi)統疾病(bing)(bing)體(ti)外實(shi)驗研(yan)究順利(li)進(jin)行的(de)(de)基礎。隨著基礎醫(yi)(yi)學及臨(lin)床醫(yi)(yi)學研(yan)究的(de)(de)逐漸深(shen)入，神(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)細胞(bao)的(de)(de)體(ti)外培養(yang)(yang)技(ji)術(shu)在腦損(sun)傷、神(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)障礙性(xing)疾病(bing)(bing)、衰老相關(guan)神(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)疾病(bing)(bing)方面得到廣泛重視和普及應用。

　　二、神經元原代培養細胞實驗步驟

　　(1)75%(體積分(fen)數)酒精消毒孕(yun)鼠,在無菌條件(jian)下取(qu)出(chu)胎鼠,分(fen)離并切取(qu)脊髓(sui),置(zhi)于冷(leng)的(de)無鈣(gai)、鎂(mei)的(de)HBSS液的(de)平皿(min)中(zhong)(下置(zhi)冰袋)。

　　(2)解剖顯(xian)微鏡無(wu)菌(jun)條件下仔細(xi)剝離脊膜及(ji)血管。

　　(3)用彈簧剪將脊髓剪成1cm3大小(xiao)，消化液37℃消化15-20min，每五分鐘振(zhen)蕩(dang)一次；

　　(4)去掉上(shang)清(qing)，加入終止(zhi)液終止(zhi)消(xiao)(xiao)化(hua)，吹(chui)打10-15次，不(bu)能有(you)氣泡，收集上(shang)清(qing)，剩(sheng)余組織再(zai)消(xiao)(xiao)化(hua)一次。

　　(5)4℃1000rpm離心10min，棄上(shang)清，加(jia)入種植液1重懸，培養箱內(nei)差速貼壁30min；

　　(6)收集上清(qing)，臺(tai)盼藍染色計數(shu)，按6*105cells/孔種入(ru)六孔板（種植液1），37℃，5%CO2，95%飽和濕度的培養箱中培養；

　　(7)培養第(di)二天，全換液更換為(wei)種植液2；

　　(8)培養第四天，半(ban)量換(huan)液(ye)加入5uM的(de)阿糖胞苷，24h全量換(huan)液(ye)；

　　(9)之后每周換液兩次。