小鼠神經元原代培養細胞實驗

一、背景

神經(jing)元原代培(pei)養是(shi)將(jiang)胚胎哺乳動(dong)物(wu)中(zhong)樞神經(jing)系統的(de)部(bu)分組(zu)織(zhi)，如大腦皮層、海馬、脊髓(sui)等腦組(zu)織(zhi)直接(jie)取(qu)出，再接(jie)種培(pei)養的(de)方(fang)法。目前國內、外(wai)有關神經(jing)元培(pei)養的(de)方(fang)法較(jiao)多，但(dan)在原代培(pei)養中(zhong)神經(jing)元的(de)純度(du)和產量方(fang)面(mian)還存在一(yi)些急待解決(jue)的(de)問題。由于神經(jing)元是(shi)一(yi)種高度(du)分化的(de)細(xi)(xi)胞，相對于其它細(xi)(xi)胞而(er)言，神經(jing)元在體(ti)外(wai)更(geng)難(nan)以存活(huo)和生長。因(yin)此，體(ti)外(wai)培(pei)養神經(jing)元要求的(de)培(pei)養方(fang)法和營養條件(jian)均較(jiao)為(wei)特殊。

神經(jing)(jing)細(xi)胞的(de)(de)體外培養(yang)技術(shu)是研(yan)究神經(jing)(jing)源性(xing)疾病的(de)(de)發(fa)病機(ji)制、進(jin)程(cheng)的(de)(de)一個重要工具，能(neng)很好的(de)(de)、直觀的(de)(de)反映離體神經(jing)(jing)元(yuan)的(de)(de)發(fa)育狀況和生理活性(xing)，如何(he)建立一個穩定成熟的神經細胞培養體系是神經系統疾病體外實驗研究順利進行的基礎。隨著基礎醫學及臨床醫學研究的逐漸深入，神經細胞的體外培養技術在腦損傷、神經障礙性疾病、衰老相關神經疾病方面得到廣泛重視和普及應用。

二、小鼠神經元原代培養細胞實驗步驟

(1)75% (體積(ji)分數)酒(jiu)精消毒孕鼠(shu),在無菌(jun)條件下取(qu)出胎鼠(shu),分離(li)并切取(qu)脊髓,置于冷的無鈣、鎂(mei)的HBSS液的平皿(min)中( 下置冰袋)。

(2)解剖顯微鏡無菌條件(jian)下仔細剝離脊膜及血管。

(3)用(yong)彈簧剪將(jiang)脊(ji)髓剪成1cm3大小，消化(hua)液37℃消化(hua)15-20min，每五(wu)分鐘振蕩一(yi)次；

(4)去(qu)掉上(shang)清，加入終止液終止消化，吹打10-15次，不(bu)能(neng)有氣泡(pao)，收集上(shang)清，剩(sheng)余(yu)組織再消化一次。

(5)4℃1000rpm離(li)心10min，棄(qi)上清，加入種植液1重懸(xuan)，培養箱內(nei)差速貼壁(bi)30min；

(6)收集(ji)上清，臺(tai)盼藍染色計數(shu)，按6*105cells/孔種入六(liu)孔板（種植液1），37℃，5%CO2，95%飽和濕度的培(pei)養箱(xiang)中培(pei)養；

(7)培養(yang)第二天(tian)，全換(huan)(huan)液更換(huan)(huan)為種(zhong)植液2；

(8)培養第四天，半量(liang)(liang)換液(ye)加入5uM的(de)阿糖胞苷，24h全(quan)量(liang)(liang)換液(ye)；

(9)之后(hou)每周(zhou)換液兩次。