大鼠神經元原代培養細胞實驗

一、背景(jing)

神(shen)(shen)(shen)(shen)經元(yuan)原(yuan)(yuan)代培(pei)養(yang)是(shi)將(jiang)胚胎哺乳(ru)動物中樞神(shen)(shen)(shen)(shen)經系統的(de)(de)部分組織，如大腦(nao)皮層、海馬(ma)、脊髓等(deng)腦(nao)組織直接取出，再接種培(pei)養(yang)的(de)(de)方(fang)法(fa)。目前國內、外有關(guan)神(shen)(shen)(shen)(shen)經元(yuan)培(pei)養(yang)的(de)(de)方(fang)法(fa)較(jiao)多(duo)，但在原(yuan)(yuan)代培(pei)養(yang)中神(shen)(shen)(shen)(shen)經元(yuan)的(de)(de)純度和(he)產(chan)量方(fang)面還存在一些急待(dai)解決的(de)(de)問(wen)題(ti)。由(you)于神(shen)(shen)(shen)(shen)經元(yuan)是(shi)一種高度分化(hua)的(de)(de)細(xi)胞(bao)，相對(dui)于其(qi)它細(xi)胞(bao)而言，神(shen)(shen)(shen)(shen)經元(yuan)在體外更難以(yi)存活和(he)生長(chang)。因此，體外培(pei)養(yang)神(shen)(shen)(shen)(shen)經元(yuan)要(yao)求的(de)(de)培(pei)養(yang)方(fang)法(fa)和(he)營(ying)養(yang)條(tiao)件均較(jiao)為特殊。

神(shen)經(jing)細胞的(de)(de)體(ti)外培養(yang)技術是(shi)研究神(shen)經(jing)源(yuan)性疾病(bing)的(de)(de)發(fa)病(bing)機制、進程的(de)(de)一(yi)個重要工具(ju)，能很好的(de)(de)、直觀(guan)的(de)(de)反映離體(ti)神(shen)經(jing)元的(de)(de)發(fa)育(yu)狀況和(he)生(sheng)理活性，如何建立一個穩定成熟的神經細胞培養體系是神經系統疾病體外實驗研究順利進行的基礎。隨著基礎醫學及臨床醫學研究的逐漸深入，神經細胞的體外培養技術在腦損傷、神經障礙性疾病、衰老相關神經疾病方面得到廣泛重視和普及應用。

二、大鼠神經元原代培養細胞實驗步驟

(1)75% (體積分數(shu))酒精(jing)消(xiao)毒(du)孕(yun)鼠(shu),在無菌條件下(xia)取出胎鼠(shu),分離(li)并切取脊髓(sui),置于冷的(de)(de)無鈣、鎂的(de)(de)HBSS液的(de)(de)平皿中( 下(xia)置冰袋)。

(2)解剖顯微鏡無菌(jun)條件下仔細(xi)剝離脊(ji)膜及血管。

(3)用彈(dan)簧(huang)剪(jian)將脊髓剪(jian)成1cm3大小，消(xiao)化液37℃消(xiao)化15-20min，每五分鐘振(zhen)蕩一次；

(4)去掉上清(qing)，加入終(zhong)止液終(zhong)止消化(hua)，吹(chui)打10-15次，不能有(you)氣(qi)泡，收集上清(qing)，剩余組織再消化(hua)一次。

(5)4℃1000rpm離心(xin)10min，棄上清，加入種植液1重懸，培養箱(xiang)內差(cha)速貼壁(bi)30min；

(6)收集上清，臺盼藍染色(se)計數，按6*105cells/孔種(zhong)入六孔板（種(zhong)植液1），37℃，5%CO2，95%飽和濕度(du)的培養(yang)箱中培養(yang)；

(7)培養第(di)二天，全換液更換為(wei)種植液2；

(8)培養第四天，半量(liang)換液(ye)加(jia)入5uM的阿糖胞(bao)苷，24h全量(liang)換液(ye)；

(9)之后每周換液兩次。